Immunobuvardage

Technique immunologique servant à détecter une protéine. Cette méthode utilise des anticorps dirigés spécifiquement contre la ou les protéines que l’on souhaite détecter. La technique consiste après migration d’un échantillon biologique sur gel, le transfert et l’immobilisation des protéines sur une membrane synthétique afin de réaliser le marquage qualitatif ou quantitatif par des techniques immuno-enzymatiques ou biochimiques.

Electrophorèse en gel de polyacrylamide

Préalablement au transfert sur membrane, les protéines peuvent être séparées par électrophorèse de façon à avoir une meilleur résolution pour la détection d’une protéine d’un mélange.

De façon simplifiée, les protéines peuvent être séparées à l’intérieur d’un gel au sein d’un champ électrique en fonction de leur poids et de leur charge. La composition de ce gel peut varier, ceci ayant une incidence directe sur la migration des protéines mais également leur structure. Essentiellement, on peut distinguer les électrophorèses en conditions natives (la structure de la protéine est parfaitement conservée) ou en conditions dénaturantes (la structure de la protéine est uniformément modifiée pour faciliter sa migration ou sa révélation ultérieure).

Transfert de protéines sur membrane

Les deux méthodes les plus communément utilisées pour le transfert des protéines sont le transfert électrophorétique pour les protéines déjà séparées en gel et la microfiltration (dot-blotting).

Le système de microfiltration est communément utilisé pour déterminer les conditions de travail pour de futurs nouveaux essais. Dans le cas d’un transfert électrophorétique, un champ électrique est utilisée pour éluder les protéines du gel pour les transférer sur la membrane. C’est une méthode rapide et précise pour transférer les protéines préalablement séparées; elle est préférentiellement utilisé pour sa force de résolution. Il existe deux méthodes pour les transferts électrophorétiques, le système semi-sec et liquide :

• Le transfert liquide est le système le plus utilisés en routine et le plus efficace pour les transferts de la majorité des protéines. Gel et membrane sont pris en sandwich dans une cuve remplit de tampon de transfert
• Le transfert semi-sec est une alternative souvent considérée comme plus simple à mettre en place. Dans ce système, le tampon de transfert est restreint au sandwich de transfert.

Membranes et tampon de transfert

Il existe principalement deux types de membrane pour le transfert des protéines ayant chacune leurs propriétés, à savoir les membranes en nitrocellulose et les membranes en polyvinylidene Difluoride (PVDF). De la même façon, il existe de nombreuses formulations pour le tampons de transfert en fonction de spécificités des protéines que l’on souhaite transférer. Parmi les plus utilisés on peut noter le tampon de transfert de Towbin (contenant du Tris, de la Glycine, du méthanol et du SDS).

Détection et révélation

Il existe plusieurs méthodes de révélation selon si l’on veut détecter les protéines totales ou détecter spécifiquement une protéine. Les méthodes de détection des protéines totales incluent les coloration anionique (Amido Black, Coomassie, Ponceau S), les marquage fluorescent, les marquages utilisant l’or colloïdal ou plus récemment la technologie stain-free.

Les méthodes de détection d’une protéine spécifique incluent les techniques chémiluminescentes et colorimétrique (HRP pour HorseRadish Peroxidase ou AP pour Alkaline Phosphatase), les techniques de fluorescences, de bioluminescences, de chemiluminescences, d’autoradiographies et de façon plus communes les immunomarquages.