Technique immunologique permettant de localiser des structures cellulaires ou moléculaires dans un tissu ou des cellules. Les cellules doivent être cultivées sur une lamelle de plastique alors que les tissus doivent être coupés en fines tranches. Plusieurs méthodes telles que le microtome, le vibratome, le cryotome permettent d'obtenir des coupes d'environ 5-50 um. Les cellules doivent être fixées et perméabilisées (dans le cas d'un antigène intra-cellulaire) afin de donner accès aux cellules par les anticorps. Un anticorps spécifique à une protéine d'intérêt est incubé, suivi d'un anticorps secondaire, reconnaissant ce premier anticorps. Par une réaction enzymatique, un substrat générant de la couleur pouvant être observée sous microscope. L'ajout d'un fluorophore permet par contre d'observer sous un microscope à fluorescence. Le fluorophore est activé par une lumière UV (excitation) et celui-ci émet de la fluorescence (émission) détectée par le microscope. Il existe plusieurs fluorophores excitant et émettant à des longueurs d'ondes différentes, générant des couleurs différentes. Il devient alors intéressant de pouvoir faire des doubles ou triples marquages, détectant ainsi 2 ou 3 paramètres simultanément.